猪圆环病毒2型（PCV2）常常和猪蓝耳病毒（PRRSV）、猪流感病毒（SIV）、猪细小病毒（PPV）、猪肺炎支原体（Mhp）等病原混合感染导致猪圆环病毒相关疾病（PCVAD），防控PCVAD已经成为全球养猪业共同面临的难题（Chae et al., 2004）。自从2004年梅里亚公司推出PCV2灭活苗以来（Reynaud et al., 2004），一些商业的疫苗陆续进入到世界各地的养猪市场，国外较有代表性的疫苗有勃林格的PCV2a-Cap蛋白亚单位疫苗和富道/辉瑞公司的PCV1-2嵌合病毒疫苗（Fenaux et al., 2004; Fort et al., 2008），在国内代表性的疫苗有PCV2灭活苗LG株和SH株。这些疫苗的免疫保护机制主要是诱导机体产生中和抗体（Fachinger et al., 2008; Fort et al., 2008; Horlen et al., 2008），细胞介导的免疫应答也起到一定的作用（Opriessnig et al., 2008）。已有大量的临床试验表明这些疫苗免疫能够降低死亡率、减少PCV2与其它病原共感染而导致PMWS的机会、明显提高平均日增重量（Horlen et al., 2008; King et al., 2008; Kixmoller et al., 2008）。

目前，随着PCV2灭活苗LG株在临床猪场中的广泛使用，不同的养猪单位逐渐对标准的免疫程序进行了调整，但是临床生产中不同免疫程序产生的抗体水平究竟如何，并未有人进行试验比较。本研究设计了不同的免疫程序，旨在评价临床生产中不同免疫程序的效果，为临床生产提供参考。

 材料方法

黑龙江省某猪场，随机选取2～4 周龄健康仔猪若干头，以耳号标记；PCV2灭活疫苗（LG株）购买自哈尔滨维科生物技术开发公司，生产批号：2013006；TIANamp genomic DNA kit购买自天根生化科技（北京）有限公司；引物由北京华大基因科技有限公司合成； Premix Ex Taq HS kit购买自TaKaRa公司。

本实验按不同日龄、不同剂量和不同免疫次数制定10组免疫程序，每组随机选取5头仔猪。一次免疫程序分组为2 周龄单剂量组（A1）、2 周龄双剂量组（A2）、3 周龄单剂量组（B1）、3 周龄双剂量组（B2）、4 周龄单剂量组（C1）、4 周龄双剂量组（C2）；加强免疫程序分组为3 周龄1头份+0.5头份组（D1）、3 周龄0.5头份+1头份组（D2）、3 周龄1头份+1头份组（D3）、空白对照组（E）。其中D3组为该疫苗的标准免疫程序。免疫后0 d、7 d、14 d、21 d、35 d采血，分离血清用于血清抗体检测和核酸检测。

采用IPMA方法对各组不同时间点的血清抗体进行检测，IPMA操作步骤参考刘长明等建立的检测方法（刘长明等，2007）。结果采用Excel和SPSS软件进行统计处理，分析各组的免疫效果及母源抗体对疫苗免疫是否存在干扰。

采用TIANamp genomic DNA kit 提取血清中病毒的DNA进行PCR扩增，检测免疫后0 d和免疫后28 d血清中病毒核酸的情况。PCR扩增采用的引物为PCV2-F56：5’- CAG CAA GAA GAA TGG AAG AAG CGG A-3’；PCV2-R1112：5’-CCA GGA CTA CAA TAT CCG TGT AAC T-3’（范培虎 等，2011），反应体系为25 μL：12.5 μL Premix Ex Taq，10 μL 无菌水，引物稀释至20 pmol/μL ，上下游引物各0.25 μL，模版2 μL。反应程序为：94℃ 2 min，[94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 1 min]×35 cycle，72℃ 10 min。结果采用Excel软件进行统计分析。

 结果

采用IPMA方法对免疫后0 d、7 d、14 d、21 d、35 d的PCV2血清抗体进行检测，结果以修正的对数值表示。处理过程是先将IPMA抗体效价转换为常数对数，然后以每份血清免疫当天的对数值减去免疫0 d 的对数值作为修正的对数值，统计如图4-1所示。图4-1A结果显示在21 dpi，A1组和对照组差异显著（p < 0.05），而A2组和对照组差异不显著（p > 0.05）；在28 dpi，A1组与A2组均和B1组与对照组差异显著（p < 0.05）。因此整体来看，这三组的免疫效果按降序排序是A1组，A2组，B1组。图4-2 B结果显示在35 dip C1组、C2组与B2组均差异显著（p < 0.05），但是在28 dip，C1组和B2组差异显著（p < 0.05），而C2组和B2组差异不显著（p > 0.05）。因此整体来看，该组的免疫效果按降序排序是C1组，C2组，B2组。图4-1C结果显示，自21 dpi后，D1、D2、D3均与对照组差异显著（p < 0.05），D1、D2、D3各组之间差异并不显著（p > 0.05），但是通过比较3组抗体的标准差发现，D3组的抗体整齐度最好，因此该组D3的免疫效果较好。挑取图4-1A、B、C各组免疫效果最好的一组在图4-1D中进行比较，结果显示在28 dpi以后，A1组和D3组抗体效价差异显著（p < 0.05）。A1组和C1组，C1组和D3组之间抗体差异均不显著（p > 0.05）。通过上述从抗体效价比较，如果临床中实施一次免疫，建议采用免疫程序C1；如果临床中实施加强免疫，建议采用免疫程序D3。

          图4-1 各个试验组免疫后PCV2血清抗体动力学

Fig 4-1 The dynamics of antibodies against PCV2 after PCV2 vaccination in each group

Fig 4-1 A : The antibodies dynamic of group A1, A2, B1 and the control ; Fig 4-1 B : The antibodies dynamic of group B2, C1, C2 and the control; Fig 4-1 C : The antibodies dynamic of group D1, D2, D3 and the control; Fig 4-1D : The antibodies dynamic of group A1, C1, D3 and the control. The “ * ” represents significant differences among groups (P < 0.05).

为了解母源抗体是否会给疫苗免疫带来干扰，本实验统计了初始免疫时不同效价的母源抗体（1: 25～1: 3200）与免疫后28 d抗体效价增加值之间的关系。结果如图4-2所示，母源抗体效价和28 dpi抗体效价增加值呈明显的负相关（r = -0.9811; p=0.0001），这表明当仔猪实施免疫时母源抗体效价越高，免疫后抗体效价增加值越低，当母源抗体效价为3lg10左右时免疫后抗体增加值为零或负值，但是猪体的抗体水平仍处于较高水平。

        图4-2 母源抗体效价与28 dpi 抗体增加值相关性分析

Fig 4-2 Correlation analysis between the increase of PCV2 IPMA titer at 28 dpi and maternally antibody

采用普通PCR检测免疫0 d和免疫后28 d的病毒血症结果发现，有36%（18/50）的试验组仔猪带有病毒血症，免疫后28天带有病毒血症的仔猪下降到20%（10/50），观察病毒血症的仔猪与正常仔猪并无临床症状的差异。除了未免疫对照组病毒血症增加了100%（2/2），其余各组病毒血症率均有下降或持平，其中D1、D2、D3组病毒血症下降尤为明显，血清中均检测不到病毒的核酸，具体数据详见表4-1。

       表4-1 免疫前后各实验组PCV2核酸检测结果

Table 4-1 The PCV2 gene detection result of each group at different time

讨论

在临床猪场中制定一套合理的免疫程序意义重大，合理的免疫程序应该是在合理的免疫时间给予动物合理的免疫剂量达到最佳的免疫保护效果。但是在临床中的疫苗免疫效果受到诸多因素的影响，比如仔猪自身的免疫系统是否发育完善，母源抗体的干扰，其它免疫抑制疾病的干扰等等（Claire-Anne et al., 2001）。本研究在临床中设计了不同的PCV2灭活苗LG株仔猪免疫程序旨在了解不同的免疫程序在临床实践中的效果。结果显示2周龄免疫效果劣于4周龄免疫效果，一方面可能是仔猪自身免疫系统还未完善，在2 周龄时不能完全接受外界刺激，产生强烈的免疫效果（Claire-Anne et al., 2003）；另一方面可能是此时母源抗体和母源细胞因子水平较高，抑制了免疫反应。整体来看，单剂量免疫效果优于双剂量免疫效果，加强免疫的效果优于一次免疫的效果，可能是因为一次注射大量抗原导致机体产生了免疫耐受，而加强免疫时可以诱导机体产生更为猛烈的免疫应答反应，因此临床中并不是免疫剂量越多越好。本研究虽然没有对细胞介导的免疫指标进行检测，但是并不影响对免疫程序的评价，一方面是因为中和抗体是评价PCV2疫苗免疫效果的核心指标（Meerts et al., 2006），另一方面是因为临床仔猪面临较多的病原刺激，检测细胞因子的变化并不一定是由疫苗免疫所导致的。

PCV2母源抗体是否干扰仔猪的免疫应答是疫苗免疫中一个重要的问题。Fort 等人以亚单位疫苗免疫高效价母源抗体仔猪和PCV2阴性猪发现高水平的母源抗体对疫苗的免疫有一定的干扰（Fort et al., 2009）。Lorenzo Fraile等人以PCV2灭活苗免疫临床仔猪发现仔猪免疫时母源抗体效价高于10 log₂时对仔猪疫苗免疫效果产生干扰（Lorenzo et al., 2012）。本研究通过母源抗体效价与免疫后28 d抗体增加值相关性分析表明，母源抗体效价越低，免疫后28 d抗体效价增加值越高。当母源抗体效价达到3 log10左右时，免疫后28d猪体内抗体未有明显变化，但是如果未实施疫苗免疫仔猪的母源抗体会逐渐衰减，因此可能是疫苗免疫后刺激机体，使体内抗体一直维持在较高水平。总之，本研究在临床条件下比较了LG株灭活疫苗不同免疫程序对仔猪的免疫效果，确定了临床条件下较为适宜的免疫程序，为科学防控PCV2提供了科学依据。                                          

                                                      统筹/夏伟

原文作者：张志慧，导师：刘长明 

单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所

题名：《猪圆环病毒疫苗临床免疫评价技术的研究》